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青莲聚焦 | 血浆低丰度蛋白富集技术怎么选?攻略来啦!

2023-09-07 00:00:00


血液是一种易于获取、稳定、微创的生物液体,其成分可以揭示组织器官的整体病理生理状况。血浆蛋白丰度范围广泛,其中丰度较高的22种蛋白质占比超过99%,而低丰度蛋白占比少于1%,却在疾病早期诊断、预后治疗、生物标志物研究方面具有重要研究价值。如何有效去除血浆中的高丰度蛋白或高效富集低丰度蛋白成为血浆蛋白质组学的关键问题。下面小编将总结去除高丰度蛋白或富集低丰度蛋白的技术原理及优缺点,带上这份攻略准备通关吧!


去除高丰度蛋白或富集低丰度蛋白的常见方法


在进行 LC-MS 定量分析之前,为降低血浆样品的高度复杂性以及高丰度蛋白对低丰度蛋白的抑制作用,需要采用适宜的前处理方法,保障测量结果的准确性和可靠性。常见的血浆样品前处理策略包括去除高丰度蛋白、预分馏以及富集低丰度蛋白。常见的方法有超滤法、沉淀法、电泳法、亲和法、色谱法、新型材料等。



图1血浆样品低丰度蛋白富集方法[1]


高丰度蛋白去除技术


高丰度蛋白去除技术是一种常见的血浆样品前处理方法,通过去除白蛋白、球蛋白、免疫球蛋白等高丰度蛋白,有效提高样品中低丰度蛋白的浓度。目前,高丰度蛋白去除的主要方法有超滤法、电泳法、抗体亲和法等。

  • 超滤法:以蛋白质的大小和结构为基础,在驱动力(通常由离心或压力条件产生)下将大分子高丰度蛋白分离出来,起到去除目的。该方法简单直接,成本低廉,没有物种限制,但对蛋白没有特异性,导致低丰度蛋白丢失严重,目前超滤法正在逐渐被淘汰。

  • 电泳法:通过电泳将血浆蛋白分离成不同的条带,实现去除高丰度蛋白的目的。蛋白质在一维电泳里按照等电点分离,在第二维电泳里按照相对分子质量分离,与超滤法相比,电泳法能够更精准地分离目标蛋白。但二维凝胶电泳耗费时间长,分辨率和灵敏度不高,一次所需上样量大且操作复杂。

  • 沉淀法:向血浆样品中添加可以引起蛋白质聚集和沉淀的试剂,如硫酸铵(AS)、三氯乙酸(TCA)、乙腈(ACN)、二硫苏糖醇(DTT)等,通过离心去除沉淀蛋白,质谱分析上清液。其主要优势为操作简单,成本低廉,没有物种限制。尽管沉淀法操作简单且被广泛使用,但其低特异性和易导致低丰度蛋白丢失限制了它的大范围应用。近年来,几种改进或优化的沉淀方法被提出,包括两步差分蛋白质溶解度方法(使用多种浓度的AS来分馏和耗尽血浆样品中的高丰度蛋白)、串联去除法(结合硫酸铵沉淀和蛋白质亲和层析)等。

  • 基于抗体的免疫亲和法:使用单克隆或多克隆抗体特异性去除血浆中的高丰度蛋白,从而纯化血浆样本。抗原与抗体结合具有良好的特异性和重复性,可用来去除那些在超滤法或电泳法中不能去除的高丰度蛋白。抗体亲和法已有很多商品化抗体亲和柱,如 Agilent、Millipore、Sigma-Aldrich、Thermo 等公司的抗体亲和柱。目前的抗体亲和柱已从开始的单抗发展到能同时去除 6 种、7 种、12 种、14种或 20 种的多亲和抗体柱(表1[2])。串联去除策略是去除更多高丰度蛋白的有效方法,如IgY4-SuperMix串联法可检测和定量血浆中的4,500种蛋白质。但基于抗体的免疫亲和法具有高成本、样品上样能力有限、超载时柱效下降等缺陷且固定化抗体可能无法识别高丰度蛋白的某些亚型。与此同时,高丰度蛋白的海绵效应也会导致去除高丰度蛋白的同时丢失部分低丰度蛋白,从而导致潜在的生物标志物丢失[3]。


表1 常见的商用去高丰度蛋白试剂盒

同时去除高丰度蛋白质和富集低丰度蛋白质

  • 基于多肽的免疫亲和法(六肽配体亲和法):基于饱和-超载色谱原理,采用一个基于微球的高度多样化的大型组合肽配体库,可即时稀释高丰度蛋白和浓缩低丰度蛋白。每个蛋白与它们的肽结合伙伴之间具有特异性的相互作用。当样品进入试剂盒后,高丰度蛋白与它们所对应的配体迅速饱和,相反,丰度较低的蛋白质不会超载它们各自的配体,从而以浓度依赖的方式结合。高丰度蛋白质的部分消耗和低丰度的相对富集导致了整体蛋白质动态范围的压缩[4]。然而,蛋白质和ProteoMiner肽库之间亲和力不同是该技术的主要局限之一。如果配体对特定蛋白质没有亲和性,或者亲和性很低,那么蛋白质就不会被捕获,从而无法被检测到。此外,pH等环境因素也可能影响其亲和力[5]。




图2 ProteoMiner技术原理(来自Bio-Rad官网)


低丰度蛋白富集技术


血液蛋白组的传统前处理策略是去除高丰度蛋白。但是有一些不常见的物种由于免疫结合的特异性无法适配市售的去高丰度试剂盒且在去除高丰度蛋白的同时会带走很多低丰度蛋白, 而丢失蛋白质信息。例如, 去除白蛋白的同时很可能会带走与白蛋白结合的细胞因子、肽类激素以及脂蛋白等低丰度蛋白。这种前处理方法有着明显的局限性。低丰度蛋白富集可以有效避免传统方法的缺陷,增加血浆蛋白组的检测深度和定量准确性。

  • 色谱预分馏技术:利用不同的色谱柱和分离机制来分离和富集血浆中的低丰度蛋白。色谱预分馏技术一般不刻意去除高丰度蛋白而是优先富集低丰度蛋白。选用不同类型的色谱柱,如离子交换柱、尺寸排阻柱等,并根据样品的性质和实验需要进行逐层分离、富集和纯化。色谱预分馏技术是一种效果比较理想的低丰度蛋白富集方法,可以较为准确地分离各种具有不同性质的蛋白质,减少低丰度蛋白的丢失,并可以借助同位素稀释质谱法实现目标蛋白的定量。但该技术需要专业的设备和技术支持,成本较高,操作难度较大耗时长。

  • 新型材料富集低丰度蛋白:近年来,磁性纳米材料在低丰度蛋白富集领域备受瞩目,其主要原理是经特殊修饰的磁球接触血浆后,表面可吸附大量蛋白质形成蛋白冠。根据“Vroman效应”,更强结合亲和力的蛋白会和早期吸附的蛋白发生竞争性置换,从而对多种低丰度蛋白质进行富集,有效避免蛋白信息丢失。拉斯维加斯3499官网将自主研发的血浆低丰度蛋白富集磁珠试剂盒(MagicOmics-DMB)、全流程自动化前处理机器人(MagicOmics-AP-96)和高通量timsTOF HT质谱仪结合,克服血浆样品复杂性高、低丰度蛋白检测深度低的难题,成功将血浆蛋白质组的检测深度提升至6000+,为血浆蛋白质组学研究带来革命性的突破!

图3 拉斯维加斯3499官网血浆蛋白质组实测数据


总结


本文中小编为您详细介绍了不同血浆高丰度蛋白去除及低丰度蛋白富集技术的原理及优缺点。目前基于抗体的免疫亲和法是血浆蛋白质组学中去除高丰度蛋白的方法。

但费用高昂以及低丰度蛋白质的协同消耗问题迫切催生了在稳定性、可重复使用性和成本方面都更有优势的磁性纳米材料富集低丰度蛋白的新技术。在选择不同技术的时候,我们需要考虑自己的研究目的和预算,同时需要充分考虑技术的优缺点和局限性,综合评估选择较适合的研究方法。


【参考文献】


[1] Cai T, Yang F. Strategies for Characterization of Low-Abundant Intact or Truncated Low-Molecular-Weight Proteins From Human Plasma. Enzymes. 2017;42:105-123. doi:10.1016/bs.enz.2017.08.004

[2] Zhao Y, Xue Q, Wang M, Meng B, Jiang Y, Zhai R, Zhang Y, Dai X, Fang X. Evolution of Mass Spectrometry Instruments and Techniques for Blood Proteomics. J Proteome Res. 2023 Apr 7;22(4):1009-1023.

[3] Nice EC, Rothacker J, Weinstock J, Lim L, Catimel B. Use of multidimensional separation protocols for the purification of trace components in complex biological samples for proteomics analysis. J Chromatogr A. 2007;1168(1-2):190-189.

[4] Li L. Dynamic range compression with ProteoMiner™: principles and examples. Methods Mol Biol. 2015;1295:99-107.

[5] D’Amici G M, Timperio A M, Rinalducci S, et al. Combinatorial peptide ligand libraries to discover liver disease biomarkers in plasma samples[J]. Liver Proteomics: Methods and Protocols, 2012: 311-319.

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